Métodos de diagnóstico micológico no basados en el empleo de cultivos

Por el Prof. Dr. Amadeo Javier Bava. Cátedra de Micología y Parasitología. Facultad de Ciencias Exactas. UNLP.

Las micosis oportunistas

El incremento observado en las últimas décadas en la prevalencia de las micosis oportunistas invasoras o diseminadas, tales como la candidiasis, la aspergilosis, la mucormicosis y la criptococosis, obligó a replantear las estrategias de diagnóstico de las mismas. La extrema gravedad y evolución aguda de estos cuadros, hacen necesario un tratamiento específico inmediato, sólo posible mediante la aplicación de procedimientos de diagnóstico certeros y rápidos.
Sin el debido diagnóstico y tratamiento las posibilidades de éxito terapéutico disminuyen, debido no sólo a la actividad de los agentes causales de la infección micótica sino a la presencia concomitante de enfermedades subyacentes (SIDA, hemopatías malignas) y/o situaciones debilitantes (tratamientos con corticoides, drogas anticancerosas e inmunodepresoras).
No obstante los adelantos importantes logrados en los últimos años, la metodología de diagnóstico disponible continúa siendo insuficiente para lograr el reconocimiento certero y temprano de estas infecciones.

Metodología de diagnóstico tradicional

Tradicionalmente, el diagnóstico de las micosis invasoras se ha basado en la visualización microscópica y el aislamiento por cultivo de sus agentes causales. Mientras que la microscopía requiere de un observador convenientemente entrenado y posee escasas sensibilidad y especificidad, el desarrollo de ciertos agentes causales en los cultivos puede ser lento o no estar en todos los casos asociado a la existencia de enfermedad. Esto último se debe a que muchos de los hongos causantes de estas micosis suelen ser habitualmente contaminantes ambientales o bien componentes de la microbiota humana.
En ocasiones, la metodología tradicional requiere de muestras que deben obtenerse mediante procedimientos cruentos e invasores (quirúrgicos, endoscópicos u otros), no siempre factibles de realizar en pacientes cuyo estado general se encuentra sumamente deteriorado. En todos los casos, para alcanzar la certeza diagnóstica se requiere en la metodología tradicional de la viabilidad de los agentes causales en las muestras y su desarrollo “in vitro” en los cultivos, lo cual no siempre es factible o se logra con la rapidez necesaria.

Métodos de diagnóstico no basados en cultivos

La administración temprana de antifúngicos específicos evita, por un lado los efectos tóxicos del tratamiento empírico y por otro la selección de cepas fúngicas resistentes, lo cual justifica el empleo de métodos rápidos de diagnóstico.
En los últimos 20 años, varios métodos que no emplean cultivos se han incorporado a la metodología de diagnóstico de las micosis invasoras, dirigidos a la detección de anticuerpos, metabolitos, antígenos y secuencias de ácidos nucleicos fúngicos en los fluidos biológicos y tejidos. Ellos poseen, entre otras ventajas, la de no requerir la viabilidad del agente causal en los materiales clínicos y sus mayores especificidad, sensibilidad y rapidez en la obtención de resultados, cuando se los compara con los métodos tradicionales. Entre sus desventajas se encuentran la falta de disponibilidad para los laboratorios de baja complejidad, la imposibilidad de reproducirlos fuera del ámbito de su creación y su elevado costo.

Determinación de anticuerpos

Si bien cuenta con la ventaja de no requerir procedimientos invasores para obtener las muestras, no siempre es de utilidad, ya que los pacientes con micosis invasoras poseen en general grados variables de incapacidad para producir anticuerpos. Por otro lado, en ciertos casos los resultados obtenidos pueden ser de difícil interpretación, como en el caso particular de la candidiasis diseminada, donde individuos sanos o enfermos por otras causas pueden igualmente tener anticuerpos séricos anti-Candida. Esto último es debido a la colonización de las superficies cutánea y mucosas por especies de este género en un número importante de individuos. Por lo dicho deducimos que, las pruebas serológicas pueden ser en ciertos casos, positivas en individuos sin candidiasis, y negativas en otros probadamente enfermos de candidiasis diseminada. Igualmente, las pruebas serológicas pueden originar resultados falso positivos debido a reacciones cruzadas ocurridas entre los agentes causales que comparten los determinantes antigénicos o bien falso negativas debido a razones técnicas.
Para corregir esto, actualmente se trabaja en la creación de técnicas serológicas que posean mayor sensibilidad, en la purificación de las moléculas antigénicas empleadas en las reacciones y en la búsqueda de anticuerpos presentes sólo en la fase activa de la enfermedad.
Tradicionalmente varias técnicas serológicas se aplicaron con éxito al diagnóstico de las micosis sistémicas endémicas clásicas (paracoccidioidomicosis, coccidioidomicosis e histoplasmosis) y actualmente de la peniciliosis, provocada por Penicillium marneffei. Sin embargo, por los motivos antes mencionados, ellas poseen limitada utilidad cuando se aplican al diagnóstico de estas micosis en los pacientes inmunocomprometidos.

Determinación de antígenos

Aplicada en fluidos biológicos (preferentemente a sangre, LCR u orina) por diferentes técnicas (aglutinación de partículas de látex [AL], radioinmunoensayo [RIE], ELISA, etc.) se ha mostrado útil en el diagnóstico de la candidiasis diseminada, criptococosis, histoplasmosis y aspergilosis invasora.
El empleo de métodos cuantitativos en la determinación de los antígenos posee valor pronóstico en el memento del diagnóstico (malo ante la presencia de títulos elevados y viceversa) y cuando es practicado en forma seriada durante el tratamiento, permite el seguimiento de la respuesta terapéutica (evolución favorable ante la disminución de los títulos y viceversa).
La determinación del (1-3)-D-glicano (presente en la estructura parietal de la mayoría de los hongos, excepto los Zygomycetes) en fluidos biológicos, permite establecer la etiología fúngica de la infección, sin discriminar acerca del agente causal de la misma. Este método permitiría al menos, en los cuadros febriles prolongados de causa desconocida, diferenciar en un principio y en forma rápida, entre la etiología fúngica y bacteriana.
La enolasa, antígenos lábiles al calor y los mananos parietales han sido los blancos elegidos para el diagnóstico de la candidiasis diseminada, mientras que el galactomanano parietal fue el escogido en la aspergilosis invasora. Sin embargo, no todas las determinaciones son igualmente sensibles, debido entre otras causas, a la formación de complejos inmunes que son rápidamente removidos de la circulación, a la presencia transitoria de los antígenos en la sangre, a la activación policlonal de la inmunidad humoral y a la falta de sensibilidad de las técnicas disponibles. Muchas veces, una prueba positiva no indica la especie fúngica involucrada en la infección, dato que actualmente suele tener relevancia debido a la emergencia de especies resistentes.
A la fecha, sólo la determinación del antígeno capsular del C. neoformans es ampliamente empleada con fines de diagnóstico. Si bien existen en el comercio equipos de AL y ELISA, el primero ha ganado mayor popularidad. Su realización y lectura son sencillas, su sensibilidad y especificidad elevadas y los resultados son obtenidos rápidamente, a partir de muestras de suero, LCR y orina.
La detección del galactomanano de Aspergillus por técnicas de AL y ELISA ha mostrado correlación con los hallazgos clínicos en la aspergilosis invasora. Igualmente, los resultados positivos deberán ser confirmados, en lo posible, por otros estudios clínicos y microbiológicos.
Para el diagnóstico de la candidiasis diseminada se encuentran disponibles equipos comerciales para la determinación de antígenos por AL y ELISA. Sin embargo, ellos carecen de la suficiente sensibilidad y pueden dar lugar a resultados falso negativos en pacientes probadamente enfermos, debido al carácter transitorio que posee la presencia de los antígenos detectados por ellos en los fluidos biológicos. Esta rápida depuración de los antígenos obliga a la toma de varias muestras en forma seriada en pacientes altamente sospechosos, a pesar de los resultados negativos.
El RIE ha sido empleado en forma eficaz para la detección del antígeno parietal del H. capsulatum en sangre, LCR y orina. Permite el diagnóstico de la histoplasmosis en pacientes inmunocomprometidos (pe: SIDA) y, cuando se realiza en forma seriada y cuantitativa, es de utilidad para el seguimiento del tratamiento antifúngico. No obstante, la prueba no se encuentra disponible comercialmente ni, como es de suponer, es accesible para laboratorios de baja complejidad. El desarrollo reciente de una prueba de inhibición de ELISA, con sensibilidad y especificidad comparables con las del RIE, para la detección de antígeno de H. capsulatum, puede solucionar este último problema.
En suma, la disociación de los complejos inmunes previo a la determinación de mananos y galactomananos, la capacidad de reproducir la prueba en todos los laboratorios, la exhibición de una sensibilidad acorde con las necesidades, la facilidad de realización de la técnica y la práctica de estudios clínicos prospectivos, son criterios a tener en cuenta a la hora de incorporar un método de diagnóstico basado en la detección de antígenos fúngicos.

Determinación de metabolitos fúngicos

Respecto al estudio de los metabolitos fúngicos en fluidos biológicos, la determinación del D-arabinitol ha sido propuesta como marcador diagnóstico para la candidiasis diseminada. No obstante, la falta de una metodología simple para su determinación cuali y cuantitativa ha impedido su empleo en forma rutinaria.
El desarrollo reciente de un método para determinar la proporción de ambos enantiómeros (D-/L) del arabinitol en fluidos biológicos, mediante una técnica automatizada, favorecen su empleo en la práctica.
De manera similar, la valoración cuali y cuantitativa de las concentraciones de manitol en fluidos biológicos de modelos animales con criptococosis y aspergilosis por A. fumigatus, ha mostrado utilidad en el diagnóstico y el estudio de la respuesta terapéutica.
Igualmente, en todos estos casos, futuros estudios deben realizarse para lograr la aceptación universal de estas determinaciones para el diagnóstico de las correspondientes micosis.

Determinación de secuencias específicas de ácidos nucleicos

Las pruebas de diagnóstico micológico basadas en técnicas moleculares pueden emplearse para la detección de secuencias de ácidos nucleicos fúngicos (tanto ADN como ARN) presentes en los materiales clínicos y para obtener la identificación rápida y precisa de los aislamientos obtenidos por cultivo.
Tienen la ventaja potencial de reducir el tiempo empleado por el laboratorio para la identificación de aquellos patógenos fúngicos que no desarrollan “in vitro” o bien lo hacen en forma dificultosa o lenta.
El estudio del polimorfismo de los fragmentos de ácidos nucleicos obtenidos con el empleo de enzimas de restricción (RFLP) o del obtenido tras la amplificación con “primers” o cebadores arbitrarios (RAPD), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el Southern Blot, etc., constituyen algunas de las técnicas moleculares empleadas a la fecha en micología. La mayor parte de ellas no se hallan por el momento al alcance de los laboratorios de diagnóstico, debido a su complejidad y costo operativo.
Aún se encuentran inconvenientes en la extracción de los ácidos nucleicos fúngicos presentes en la muestra o dentro de las células y problemas técnicos asociados a las al riesgo de contaminación, a la imposibilidad de diferenciar la colonización de la infección fúngica verdadera y de determinar la viabilidad del hongo cuyo ácido nucleico se ha determinado.
El empleo de sondas (oligonucleótidos de cadena simple, complementarios de las porciones específicas de los ácidos nucleicos investigados), brinda una gran especificidad a estas pruebas, ya que permite la identificación precisa de un aislamiento a nivel de cepa.
No obstante su enorme valor epidemiológico, el empleo en forma directa de sondas sobre materiales clínicos carece por lo general de la suficiente sensibilidad para su uso como método de diagnóstico directo. Por el contrario, la amplificación millones de veces de secuencias específicas fúngicas eventualmente presentes en las muestras, mediante la PCR, posibilita su aplicación. La sensibilidad de la PCR puede mejorarse aún más con el empleo de la “nested PCR”, que consiste en la realización de una nueva PCR sobre los productos obtenidos durante la primera.
El uso de “primers” o cebadores que poseen su sitio de acción en genes de copias múltiples provee a estas pruebas de un alto grado de sensibilidad, indispensable para el diagnóstico temprano de las micosis en pacientes graves. No queda claro si los métodos que investigan la presencia de secuencias existentes en muchas especies fúngicas o aquellos específicos para una o unas pocas especies serán de mayor utilidad en la práctica clínica.
La hibridación “in situ”, efectuada sobre tejidos eventualmente infectados, inclusive aquellos fijados con formol para su procesamiento histopatológico, permite reconocer la presencia de secuencias específicas fúngicas mediante sondas marcadas. Sin embargo, un inconveniente de esta técnica es su baja sensibilidad, debido a que en ella no se efectúa la amplificación de los ácidos nucleicos investigados en los tejidos.

Conclusión

Durante las últimas décadas, la micología médica ha encontrado limitaciones en el diagnóstico de las infecciones fúngicas invasoras, principalmente para asociar rapidez y seguridad al diagnóstico obtenido.
La ocurrencia de cultivos negativos en materiales provenientes de individuos probadamente enfermos, o bien la positivización de los mismos en estadios avanzados de la enfermedad, limitan la aplicación de estas técnicas.
Igualmente, cuando un cultivo es positivo, la identificación precisa del hongo desarrollado, mediante su estudio micromorfológico, por pruebas bioquímicas y/o serotipificación, es laboriosa y tarda un tiempo muchas veces no disponible.
La rápida instalación de un tratamiento antifúngico específico incrementa las posibilidades de éxito en las micosis invasoras de los huéspedes severamente inmunocomprometidos. Los métodos de diagnóstico que no requieren de cultivos son ideales para obtener en forma rápida, certera y en etapas tempranas de estas enfermedades la etiología de las mismas.
El reconocimiento de los agentes causales al nivel de especie importa en estos tiempos, por la permanente eclosión de especies fúngicas resistentes a los compuestos en uso, como agentes causales de enfermedad.
La identificación al nivel de cepa, difícil de obtener con la metodología tradicional basada en el reconocimiento de las características fenotípicas, adquiere relevancia desde el punto de vista epidemiológico, ya que posibilita encontrar el origen de una infección o brote epidémico y aumenta las posibilidades de controlarlo.
Mientras que la determinación de los antígenos y metabolitos fúngicos en fluidos biológicos es, en las micosis invasoras, directamente proporcional a la carga fúngica, la PCR posibilita la amplificación “in vitro” millones de veces de unas pocas secuencias presentes en los materiales clínicos en un breve lapso.
Es probable que muy pronto, mediante la observación de un preparado al microscopio, podamos en forma rápida, determinar el género y la especie del microorganismo visualizado, así como su sensibilidad a determinados antibióticos.
A pesar de lo atractivo que suele ser el empleo de todos estos métodos, cabe destacar que los mismos no desplazan ni invalidan el uso de las técnicas tradicionales, sino que complementan a las mismas. Por otro lado, ellos deben cumplir con los requisitos mencionados en los párrafos anteriores antes de ser incorporados a la batería de pruebas diagnósticas.

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