Para que una medida de la concentración de un analito efectuada en una muestra pueda ser comparada frente a un rango de valores normales de referencia, o frente a medidas de otros pacientes o comparada con las del mismo paciente es necesario conocer la confiabilidad de esa medida.
Es necesario contar con una herramienta que permita establecer si una diferencia en las medidas, observada entre muestras, se debe a diferencias en la concentración del analito en dichas muestras o si la diferencia observada se debe a factores metodológicos utilizados para la determinación de esas medidas.
En un laboratorio de análisis clínicos, de acuerdo a los métodos utilizados, se puede clasificar a los análisis en: Análisis Cuantitativos y Cualitativos.
En este artículo sólo nos ocuparemos de analizar los Análisis Cuantitativos.

Análisis Cuantitativos

Estos análisis pueden ser requeridos con dos fines diferentes

a. Determinar si la concentración de un analito responde a un estado fisiológico o patológico.

b. Determinar cambios de concentración de un analito en un mismo paciente como respuesta a un tratamiento, a una estimulación o por la evolución de una enfermedad (marcadores oncológicos, virales, etc).

En este último caso las determinaciones pueden no ser efectuadas en el mismo proceso de medición y pueden estar separadas por un periodo de tiempo que obligue a un nuevo proceso de calibración y/o a cambios de los reactivos (nuevo lote) aún manteniendo la misma marca de origen del reactivo.
En los análisis cuantitativos intervienen, además del proceso de medición, otros aspectos involucrados en la calidad del resultado obtenido, tales como:
a. Los relacionados a la muestra del paciente.
b. El sistema de medición.
c. El procesamiento de los datos experimentales, que dan lugar al resultado.
d. La determinación de la calidad del resultado.
e. La información clínica obtenida a través de ese resultado (rango de referencia).

Antes de analizar los procedimientos a seguir para estimar esa calidad, resulta necesario revisar algunas definiciones actualmente utilizadas en metrología según normas ISO.
Estas definiciones pueden no coincidir con las utilizadas en el pasado, sin embargo el concepto sigue siendo el mismo. Si se dispone de una muestra de una concentración conocida que es aceptada universalmente como verdadera, se define como exactitud (accuracy) de un resultado de la muestra, a la concordancia entre el resultado de la medición y el valor verdadero de la muestra.
Esa concordancia se establece como la diferencia entre: Valor medido -Valor verdadero = Error total de la medida (1)
Nota: obsérvese que se aplica a un solo resultado
Se define como precisión (precision) a la concordancia entre los resultados independientes de las mediciones de la misma muestra. La precisión es un reflejo de la reproducibilidad del proceso de medición utilizado.
Se entiende por resultados independientes a aquellos que han sido determinados en repetidos procesos de medición con el uso de diferentes lotes de reactivos.
Para determinar la precisión de un resultado es necesario conocer el Valor más probable de la muestra para el sistema de medición elegido.
El Promedio o Valor medio, de los resultados independientes de las mediciones de la muestra, es un reflejo del Valor más probable de la muestra ensayada, para el Sistema de Medición elegido.
La precisión de un resultado queda definida por la diferencia entre:
Valor medido - Valor más probable = Error de precisión (2)
Si el número de resultados analizados es estadísticamente significativo, el desvío standard de esos resultados respecto del valor medio, reflejará el grado de precisión del Sistema de Medición empleado.
Se define como veracidad (trueness) del método de medición, a la concordancia entre el Valor más probable (promedio o valor medio de los resultados independientes) y el Valor verdadero asignado a la muestra.
La veracidad de un resultado queda definida por la diferencia entre:
Valor más probable -Valor verdadero = Error Sistemático (3)
Como la exactitud de un resultado, determinado en un único proceso de medición, se manifiesta a través del Error Total.
Se puede escribir:
de (2) que:
Valor medido = Valor más probable + Error de precisión (4)
de (3) que:
Valor más probable = Valor verdadero + Error Sistemático (5)
Reemplazando Valor más probable en (4) por su igual en (5)
Valor medido = Valor verdadero + Error Sistemático + Error de precisión (6)
Por lo tanto la expresión de la exactitud definida como:
Error total = Valor medido -Valor verdadero
corresponde a:
Error total = Error de precisión + Error Sistemático (7)
Nota: Mientras que el Error de Precisión puede adoptar diferentes valores con signo positivo o negativo, el Error Sistemático mantiene siempre el mismo valor con su signo, ya sea que resulte positivo o negativo.
Sin embargo, este planteo teórico no es aplicable en la práctica diaria en el Laboratorio de Análisis Clínicos, por cuanto no disponemos de muestras cuyo valor verdadero haya sido certificado, o en el caso de poder contar con ellas, su uso en la rutina no es viable.
El análisis de precisión y veracidad sólo es válido para la concentración ensayada y no puede ser extendido a todo el rango de medición sin un estudio previo.
Sin embargo, es necesario poder disponer de una información objetiva que permita evaluar la calidad de un resultado, con el fin de permitir comparar este resultado frente a valores de referencia o con resultados anteriores del mismo individuo o frente a resultados de otros individuos.
Para evaluar la calidad de un resultado se han establecido normas Internacionales, como la ISO 15189 (específica para los Laboratorios de Análisis Clínicos), que indica utilizar como parámetro asociado a la Incertidumbre de la Medición.

Incertidumbre y su aplicación en el laboratorio clínico

De acuerdo con las normas ISO, la incertidumbre en una medición es:

“EI parámetro asociado al resultado de un proceso de medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos a la muestra.”

Esta definición puede ser difícil de aplicar en la práctica, por lo cual debe ser ampliada y explicada para saber cómo puede ser usada con el fin de evaluar la performance de un método dado.
Cuando un proceso de medición es evaluado con un número elevado de replicados, es posible determinar un valor medio y un parámetro estadístico que nos indica la dispersión de los resultados. Este parámetro puede ser el DS (Desvío Standard). En estos casos el 95% de los resultados encontrados estarán comprendidos en el rango de X ± 2 DS.
En la práctica diaria no contamos con un número de replicados de mediciones de una muestra de un paciente, que hayan sido determinadas en procesos de medición independientes, para poder aplicar estos conceptos estadísticos.
Determinamos un único resultado cuya posición en el rango de distribución de valores probables desconocemos. No sabemos si el valor encontrado está cercano al valor más probable (X) o si acaso está en el límite del rango superior X + 2 DS o del límite inferior X -2 DS.
En resumen, es necesario saber, con la información y conocimiento del método empleado, dentro de qué límites podría encontrarse el resultado del paciente. Estos límites no privilegian al valor determinado, sino por el contrario indican un rango en el cual todos los valores tienen la misma probabilidad de haber sido determinados en el mismo proceso de medición (distribución rectangular).
Si la incertidumbre de la medición fuera U y la medición es X, el rango de incertidumbre en el cual podría estar el resultado del paciente es de (X -U) a (X + U), donde X es un valor más de las posibles mediciones.
Es decir que el valor o resultado de la medición no es un valor único sino una familia de valores probables.
Fuentes de incertidumbre
Es necesario conocer el procedimiento completo a fin de evaluar las fuentes de incertidumbre y establecer cuantitativamente un porcentaje de variación que cada fuente puede presentar.
Se han descripto las posibles fuentes de incertidumbre:

1- Obtención, Estabilidad y Conservación de la muestra: Si la muestra requiere una preparación previa antes de ingresar en el sistema de medición. todas las variaciones derivadas de estos procedimientos están contenidas en la Incertidumbre (extracción, precipitación, conservación, etc).
2- Reproducibilidad del Método de Elaboración de los Reactivos y Calibradores. Variaciones de propiedades entre diferentes lotes.
3- Variaciones en el Sistema de Medición.
Reconstitución y Conservación de los reactivos.
Variaciones de la Calibración del Sistema de Medición debido a la variación de la concentración de los patrones y/o a los errores casuales del operador e instrumentos de medida, o cambios en la matriz de los calibradores.
4- Variaciones de los Instrumentos y elementos utilizados en el procedimiento analítico (pipetas, temperatura de baños de incubación, observancia de la técnica analítica, variaciones en los aparatos de medición. etc.).
5- Variaciones debidas al uso de diferentes modelos de cálculo (software).
6- Y todo otro factor cuya variación provoque un cambio en el valor de la medida.
La estimación matemática de la Incertidumbre de la Medición. debido a cada una de estas fuentes, puede hacerse siguiendo dos caminos: A través del procedimiento de tipo A, se estima la Incertidumbre Standard - u(xi) y a través del procedimiento de tipo B, la Incertidumbre Standard Combinada - uc(y).

Procedimiento tipo A

La estimación de la Incertidumbre Standard está basada en la determinación del Desvío Standard de los valores replicados en procesos diferentes.
En este punto se debe aclarar que cada valor determinado (replicado) está referido a un proceso de medición completo que incluye un nuevo proceso de calibración y reactivos de diferentes lotes.
La carta de Control de Calidad (QC), con tres niveles de concentración: bajo, medio y alto, puede ser una excelente fuente para la determinación de la u(QC).
Con estos valores se puede estimar la u(xi) a lo largo del rango de medición.

Procedimiento tipo B

Se aplica cuando no puede ser estimado un valor estadístico de Desvío Standard o cv % (coeficiente de variación) de acuerdo a las exigencias del procedimiento A.
El profesional con su experiencia e información y conocimiento del método, deberá estimar para cada una de las fuentes de incertidumbre un valor de Incertidumbre relativo porcentual.
Con estos valores determinará la Incertidumbre Standard Combinada [(uc(y)].
Para sumar las incertidumbres relativas se aplica el mismo criterio que se sigue para el cálculo de propagación de errores.
La estimación de la Incertidumbre por cualquiera de los dos procedimientos tiene el mismo significado, aunque de poder hacerse, se recomienda seguir el de tipo A.
En ambos casos el valor calculado se denomina Incertidumbre Standard (us).
La Incertidumbre Expandida (U) es la expresión del rango tomando el 95% de probabilidad que la medición está dentro de ese rango, para lo cual:
U = k · u s
generalmente se acepta que: k = 2 , por lo tanto la medición queda expresada como:
Valor medido ± 2 u s ; o
Valor medido ± U

Cálculo de la Diferencia Mínima D significativa entre dos mediciones

La diferencia mínima D entre dos mediciones X1 y X2 que permite establecer si el cambio es significativo se calcula como:
D = 3 x u s
Es decir, que para considerar que Xl y X2 son distintos la diferencia entre ambos debe ser mayor o igual a D.
Una propiedad del rango de incertidumbre es que dentro de dicho rango se encuentra el valor más probable de la medición, que sólo podría ser determinado con n repeticiones en procesos diferentes.
El concepto de incertidumbre tal como fue definido anteriormente ofrece una alternativa frente al cálculo del error total para describir las variaciones inherentes a las mediciones e indica la calidad del método empleado.
Es importante distinguir que la Incertidumbre no se relaciona con la Exactitud del resultado, ni con su Veracidad, sino que depende de la capacidad de todo el proceso de medición para reproducir la medición, es decir con la Precisión del Método.
Esta Precisión es dependiente no sólo del usuario de los reactivos, sino también de la capacidad del elaborador para reproducir la calidad y características de cada uno de los componentes de un kit, especialmente de los patrones y del reactivo específico para el analito en estudio.

Interpretación clínica de la medición

En nuestra actividad, a diferencia de un laboratorio de química analítica, existe otro factor de igual importancia que la calidad de la medición y es el Rango de Referencia de los Valores Normales del Método empleado.
Este Rango de Referencia tiene el mismo Error Sistemático en las concentraciones allí indicadas que las mediciones individuales. El “corrimiento” que se observa en las mediciones de un método, se ve reflejado del mismo modo en el Rango de Referencia. Por ello, el componente del Error Sistemático en el Error total, no ha afectado el uso de diferentes Sistemas de Medición y marcas de Reactivos durante años.
La correcta Interpretación Clínica del resultado informado depende, en mayor medida, de la certeza del rango de referencia informado para el método elegido, que de la “veracidad” de la medida.
En este sentido es necesario recordar la importancia de informar los resultados con los valores de referencia correspondientes al método empleado.
Cuando se determinan los valores de referencia para un método, debe considerarse el rango de incertidumbre correspondiente para cada una de la mediciones efectuadas con ese fin.

Integrantes del Taller de Inmunoanálisis:
• Dr. Samy Cembal
• Dr. Jorge Ambrosio
• Dr. Claudio Aranda
• Dra. Miriam Colombani
• Dra. Cecilia Fenili
• Dr. Erich Fradinger
• Dra. Alicia Klecha
• Dra. Débora Sragowicz
• Dra. Cecilia Zylbersztein
• Lic. Marcelo Volta